近年來,随着遺傳病和癌症等疾病的發病率進一步上升,陽離子聚合物(polycation)等因可作為基因載體而用于基因治療,受到人們越來越多的關注。帶正電荷的陽離子聚合物可以與帶負電荷的DNA相互作用并形成複合物(polyplex),适用于基因轉染。與病毒載體相比,雖然陽離子聚合物介導的基因轉染效率較低,但具有易制備、易保存和低免疫原性等優點,具有非常重要的研究意義和廣闊的應用前景。從來源上說,這些陽離子聚合物主要包括兩大類,即合成高分子如聚乙烯亞胺(PEI)和天然高分子如殼聚糖(chitosan)。這些陽離子聚合物大都有一定的轉染效率(以PEI為對照),然而,關于其具體的作用機理等一些基本問題的研究尚存不足。本論文以這些常見的陽離子聚合物及其衍生物為例,對若幹現存問題進行了深入的探讨,具體工作如下所述。1.以O-未甲基化N,N,N-三甲基殼聚糖(TMC)為研究對象,研究了陽離子聚合物鍊長度和轉染率的關系,并探讨了影響這一結構／功能關系的因素。一般而言,鍊長較長的陽離子聚合物介導了較高的轉染率,然而,對殼聚糖及其衍生物(如TMC),已有的文獻報道中并不符合這一規律。我們在合成了四種鍊長度不同的O-未甲基化TMC的基礎上,對其結構進行了明确的表征。由于在制備這些TMC的過程中基本不發生副反應,因此适合對其結構／功能關系的研究。通過熒光素酶(luciferase)在非洲綠猴腎細胞(COS-7),人胚腎細胞(293T)和人非小細胞肺癌細胞(NCI-H1299)中的表達以及綠色熒光蛋白(EGFP)在293T細胞中的表達,發現分子鍊越長的TMC介導的轉染效率越高,即TMC也符合鍊長較長的陽離子聚合物介導了較高的轉染率這一規律。究其原因,發現其主要的影響因素包括polyplex的穩定性、内吞方式和細胞内轉運途徑,而非陽離子聚合物與pDNA的結合能力、polyplex的粒徑、zeta-電勢、血清、細胞毒性或内吞效率。值得注意的是,通常認為影響轉染效率的因素,如細胞毒性和内吞效率,并不影響這一結構／功能關系。因此,在制備陽離子聚合物特别是殼聚糖基陽離子聚合物作為基因載體時,應特别注意polyplex的穩定性、内吞方式和細胞内轉運途徑。2.以PEI及其衍生物為研究對象,研究了它們在有血清和無血清測試條件下最優氮磷比(N/P比,陽離子聚合物中氮的摩爾含量與DNA中磷的摩爾含量之比；最優N/P比即轉染效率最高時的N/P比)的變化,以及其他一些可能影響最優N/P比的因素。在己有的報道中,陽離子聚合物的轉染效率大都在不同條件下采用特定的N/P比(或質量比)進行檢測。但實際上,随着條件的不同,其最優N/P比(陽離子聚合物介導的基因載體的轉染效率達到最高時的N/P比)也會不同。因此,若采用若幹特定的N/P比進行研究,結論可能不甚合理。本文就這一問題通過PEI及其衍生物進行了深入探索。研究中所合成的PEI的衍生物包括甲基化PEI、季胺化PEI、乙酰化PEI、丙氨酸改性的PEI、賴氨酸改性的PEI、PEG化的PEI、胍化的PEI及咪唑基團改性的PEI等,通過NMR和元素分析等對這些PEI的衍生物進行明确的表征。在COS-7細胞中的轉染實驗結果表明,PEI及其衍生物的最優N/P比各自不同,例如未改性的PEI的最優N/P比在6-10,而丙氨酸改性的PEI的最優N/P比在40-80,PEG化的PEI的最優N/P比不小于100。另一方面,與無血清存在的條件下相比,有血清時這些最優N/P比将顯著變大,例如在10%血清條件下,未改性的PEI的最優N/P比在20-30,丙氨酸修飾的PEI的最優N/P比不小于100,PEG化的PEI的最優N/P比不小于250,等等。同時,通過研究相應的測試條件對PEI轉染率的影響,發現polyplex的制備條件、複合物的劑量、培養基的添加物及細胞系的種類同樣會影響其轉染率和最優N/P比。因此,我們認為,在測定陽離子聚合物作為基因載體的轉染效率時,應充分認識到測試條件與最終結果之間的關系。特别是将PEI用作對照時,需證明并采用PEI的最優條件。3.以TMC/pDNA polyplex (TMC-P)和PEI自由鍊(PEI-F)為研究對象,探讨了陽離子聚合物自由鍊在其介導的基因轉染中的作用。一般而言,在N/P比較低時,陽離子聚合物便能和pDNA形成較穩定的polyplex;而較高的轉染效率隻有在N/P比較高時才能達到。因此,有一部分陽離子聚合物自由鍊對有效的基因轉染起到了非常重要的作用。由于PEI-P在細胞培養基中不穩定,當探索陽離子聚合物自由鍊所扮演的角色時,以PEI-P/PEI-F為研究對象并不能很好地排除二者的相互作用。但是,TMC-P/PEI-F的研究體系在DMEM中卻非常穩定,且采用不同種類的polyplex和自由鍊,能夠更好地研究自由鍊的功能。通過TMC-P/PEI-F介導的熒光素酶的表達,我們發現PEI-F能有效提高TMC-P的轉染效率。通過在含有細胞内吞通路抑制劑情況下的基因表達,我們發現網格蛋白抑制劑對PEI-P/PEI-F有明顯的抑制效果,對TMC-P/TMC-F無抑制效果,然而對TMC-P/PEI-F則有一定的抑制效果；此外,質子泵抑制劑對TMC-P/PEI-F的抑制效果也介于PEI-P/PEI-F和TMC-P/TMC-F之間。可見自由鍊能明顯影響polyplex的内吞方式和細胞内轉運途徑。此外,這些陽離子自由鍊本身作為高分子治療(polymer therapy)的一種方式值得進一步深入研究。事實上,陽離子聚合物介導的基因轉染是一個極為複雜的過程。從聚合物結構的設計,到polyplex的制備和運輸,再到與靶細胞的識别和内吞,乃至細胞内的轉運,最終到達細胞内靶位并産生作用,整個過程都需要精心的構思與細緻的設計,但這些均建立在對基因轉染整個過程深入了解的基礎之上。因此,本論文不僅就陽離子聚合物作為基因載體的若幹基本問題進行了深入的研究和探索,其結果也為合理設計及表征用于基因載體的新型陽離子聚合物提供了理論基礎和實驗依據。
